Creative Diagnostics抗体偶联药物（ADCs）生物分析

概述

抗体偶联药物（ADC）是一类通过将细胞毒性小分子化合物共价连接至单克隆抗体而成的药物，可增强传统抗肿瘤小分子药物的靶向性并降低毒副作用。由于ADC结构的异质性及体内药物抗体比（DAR）的动态变化，其生物分析面临巨大挑战。药代动力学（PK）是解读药物疗效与安全性的物质基础，其重要性不言而喻。另一大挑战是抗治疗药物抗体（ATA）的评估，因其可能对药代动力学研究结果产生显著影响。

生物分析的关键考量

●ADC的异质性

ADC实为混合物：其抗体通过连接子与小分子药物共价结合，可连接于抗体赖氨酸侧链、链间二硫键还原产生的巯基，或抗体特定位点引入的工程化半胱氨酸¹⁻³。

●体内DAR值的动态变化

ADC在血浆中理论上稳定，但在特殊条件下连接子仍可能断裂，导致小分子药物解离。这种解离会改变DAR值或产生新的DAR分布。研究表明，ADC的清除率随DAR值升高而增加⁴。

●待测物的选择

小分子药物与蛋白药物的暴露-效应关系（ER）可通过检测原药获知。然而ADC同时包含抗体与小分子药物组分，且体内DAR值动态变化、临床数据有限，因此难以确定何种物质影响ER。通常在ADC开发早期，会尽可能多地检测各类物质以全面了解其PK特征，一般包括：总抗体、ADC、游离小分子药物。此外，ADC进入体内可能产生ATA，可能降低ADC疗效，故需在开发中对其进行评估。

图2. 抗体偶联药物的待测物类型。（Kaur, S. 等，2013）

DAR分析

DAR分析包含两个层面：

1. 平均DAR：系统中毒素分子与抗体分子的摩尔浓度比；

2. DAR分布：不同DAR值的ADC在总ADC中的占比。  

常用方法：光谱法、高效液相色谱-紫外法（HPLC-UV）与质谱法。

药代动力学分析方法

▶总抗体的测定

• 间接ELISA：使用包被抗原捕获总抗体，再根据抗体种属属性选择二抗作为检测抗体⁵。优点：应用广、技术成熟；缺点：有时难以获得商用抗原。

• 电化学发光法（ECLA）：采用更高灵敏度、更宽动态范围的电化学发光技术（如Meso Scale Diagnostics公司的MSD仪器）。

▶偶联抗体的测定

偶联抗体指结合小分子药物且DAR ≥ 1的抗体，多采用ELISA检测。

• 桥连ELISA：基于生物素与亲和素/链霉亲和素结合的高特异性和信号放大效应（一分子亲和素可结合四分子生物素）设计，用于放大检测信号。

▶结合型小分子药物的测定

通常先将ADC与游离小分子毒素分离，再通过化学反应或酶解释放小分子毒素，最终通过ELISA或LC-MS/MS准确定量。

• ELISA：选用抗独特型抗体、抗原胞外区（ECD）或抗人IgG抗体捕获ADC的抗体部分，以抗小分子药物抗体作为检测试剂。

• LC-MS/MS：先用试剂（如蛋白A、抗独特型抗体、抗原等）捕获偶联抗体，去除连接臂后，对小分子药物进行LC-MS/MS分析。

▶游离小分子药物的测定

指已从抗体上解离的药物部分，可采用竞争ELISA⁷与LC-MS/MS⁸检测。

• 竞争ELISA（以游离DM1检测为例）：样品经乙腈沉淀后，含游离DM1的上清与生物素化小鼠抗DM1抗体混合，转移至包被BSA-DM1的酶标板。样品中DM1会与包被BSA-DM1竞争性结合抗DM1抗体——样品中DM1浓度越高，BSA-DM1结合的抗DM1抗体越少，链霉亲和素-HRP检测的信号越低。

ATA分析

ADC的ATA结合表位可能是其三个组分（抗体、连接子、药物）之一或其组合。ATA通常采用配体结合分析（LBA），捕获试剂通常为固相ADC，理论上可捕获靶向不同表位的所有ATA。分析一般分为两步：

1. 筛选分析：初步检测ATA；

2. 确证分析：验证免疫应答的特异性。  

可使用的技术包括ELISA、桥连ELISA、ECLA、放射免疫沉淀法（RIP）、表面等离子共振（SPR）等，各方法均有优缺点。

治疗性单抗药物监测

Creative Diagnostics提供符合ISO 13485质量管理体系开发的32种生物药监测ELISA试剂盒，由专家科学家按CLSI与FDA指南进行质控。

参考文献

1. Hab. 等. Trastuzumab emtansine (T-DM1): a novel agent for targeting HER2+ breast cancer. Clin Breast Cancer. 2011.  

2. Sun, MM. 等. Reduction-alkylation strategies for the modification of specific monoclonal antibody disulfides. Bioconjug Chem. 2005.  

3. Junutula, JR. 等. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nat Biotechnol. 2008.  

4. Hamann, PR. 等. Gemtuzumab ozogamicin, a potent and selective anti-CD33 antibody-calicheamicin conjugate for treatment of acute myeloid leukemia. Bioconjug Chem. 2002.  

5. Kaur, S. 等. Bioanalytical assay strategies for the development of antibody-drug conjugate biotherapeutics. Bioanalysis. 2013.  

6. Jenkins, R. 等. Recommendations for validation of LC-MS/MS bioanalytical methods for protein biotherapeutics. AAPS J. 2015.  

7. Xie, H. 等. Pharmacokinetics and biodistribution of the antitumor immunoconjugate, cantuzumab mertansine (huC242-DM1), and its two components in mice. J Pharmacol Exp Ther. 2004.  

8. Hoofring, SA. 等. Immunogenicity testing strategy and bioanalytical assays for antibody-drug conjugates. Bioanalysis. 2013.

更多产品信息，请联系中国区域代理商：AMJS澳金沙门官方入口

（注：本文内容基于品牌公开资料及行业常规信息整理，具体以品牌信息文档为准。）